Question

4．已知圖1、圖2中標注了相關(guān)限制酶的酶切位點，且限制酶的切點是唯一的，外源DNA插入會導致相應(yīng)的基因失活．請回答有關(guān)基因工程操作的問題：

（1）圖1表示的是一個經(jīng)過人工改造的作為載體的質(zhì)粒，其化學本質(zhì)是環(huán)狀DNA分子．作為基因表達載體，除圖1所示結(jié)構(gòu)外，還需具有目的基因和終止子．
（2）根據(jù)圖中所給信息，構(gòu)建基因表達載體時，應(yīng)選用的限制酶是BclI和HindⅢ．若將基因表達載體導人大腸桿菌，一般先用鈣離子處理，使其成為感受態(tài)細胞，以利于吸收周圍環(huán)境中的DNA分子；然后讓基因表達載體在緩沖液中與該細胞混合，調(diào)控溫度完成轉(zhuǎn)化過程．
（3）為了篩選出含目的基因的大腸桿菌，應(yīng)在培養(yǎng)基中添加四環(huán)素，培養(yǎng)一段時間后，平板上長出的菌落，用PCR技術(shù)鑒定時，所用的引物是圖2中引物甲和引物丙．

Answer 1

分析 基因工程技術(shù)的基本步驟：
1、目的基因的獲�。悍椒ㄓ袕幕�因文庫中獲取、利用PCR技術(shù)擴增和人工合成．
2、基因表達載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等．
3、將目的基因?qū)�入受體細胞：根據(jù)受體細胞不同，導入的方法也不一樣．將目的基因?qū)�入植物細胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)�入動物細胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)�入微生物細胞的方法是感受態(tài)細胞法．
4、目的基因的檢測與鑒定：
（1）分子水平上的檢測：①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術(shù)；②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA--分子雜交技術(shù)；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)--抗原-抗體雜交技術(shù)．
（2）個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等．

解答 解：（1）圖1表示的是一個經(jīng)過人工改造的作為載體的質(zhì)粒，質(zhì)粒的化學本質(zhì)為小型環(huán)狀DNA；基因表達載體的組成包括啟動子、終止子、目的基因和標記基因等．
（2）選擇的限制酶應(yīng)在目的基因兩端存在識別位點，但BamHⅠ可能使質(zhì)粒中的啟動子丟失，因此只能選BclI和HindⅢ兩種限制酶切割．將目的基因?qū)�入微生物細胞常用感受態(tài)細胞法，即用Ca²⁺處理，使其處于感受態(tài)，以利于吸收周圍環(huán)境中的DNA分子；然后讓基因表達載體在緩沖液中與該細胞混合，調(diào)控溫度完成轉(zhuǎn)化過程．
（3）了篩選出轉(zhuǎn)入了重組質(zhì)粒的大腸桿菌，根據(jù)質(zhì)粒上的抗性基因，應(yīng)在篩選平板培養(yǎng)基中添加四環(huán)素．PCR技術(shù)要求兩種引物分別和目的基因的兩條單鏈結(jié)合，沿相反的方向合成子鏈，故所用的引物組成為圖2中引物甲和引物丙．
故答案為：
（1）人工改造      環(huán)狀DNA分子    目的基因和終止子
（2）BclI和HindⅢ感受態(tài)    緩沖液
（3）四環(huán)素    引物甲和引物丙

點評 本題結(jié)合基因結(jié)構(gòu)圖和運載體結(jié)構(gòu)圖，考查基因工程的技術(shù)和原理，重點是限制酶和DNA連接酶，要求考生認真分析圖1和圖2，能根據(jù)圖中和表中信息選擇合適的限制酶，準確判斷使用DNA連接酶連接的結(jié)果，再運用所學的知識答題．