Question

【題目】L-肉堿具有參與脂肪氧化、抗疲勞、延遲患阿爾茨海默綜合癥等功能。據報道大腸桿菌能將巴豆甜菜堿轉化成L-肉堿，但效率較低�？蒲腥藛T通過基因工程將BCD基因、F基因以及T基因導入到大腸桿菌細胞內以提高L-肉堿的轉化率。實驗過程及結果如下圖所示，分析并回答下列問題：

Kan 卡那霉素抗性基因

CAT 氯霉素抗性基因

（1）實驗過程中用PCR技術獲得目的基因，PCR反應體系需要加入的有機物有DNA模板、dNTP、耐高溫DNA聚合酶和____________。實驗過程中不能將BCD基因、F基因以及T基因直接導入到大腸桿菌細胞內，而是構建重組質粒后再導入大腸桿菌，原因是____________，并能遺傳給下一代.圖中兩個重組質粒目的基因的首端都含有啟動子T7，T7是____________識別和結合的部位，能驅動基因轉錄。

（2）將重組所粒1和重組質粒2導入大腸桿菌時，應用________處理大腸桿菌，使細胞處于____________________的感受態(tài)。

（3）為了篩選出同時含有BCD基因、F基因以及T基因的大腸桿菌，實驗的思路是______________。

（4）研究發(fā)現巴豆甜菜堿轉化成L-肉堿是一個可逆反應過程，得到的工程菌在含有巴豆甜菜堿培養(yǎng)基中培養(yǎng)2小時后，L-肉堿的含量基本穩(wěn)定，此時可以____________________，使反應向生成L-肉堿的方向進行，以提高產量。

Answer 1

【答案】（兩種）引物 使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并能夠得以表達（使目的基因在受體細胞中完成轉化） RNA聚合酶 Ca2+ 易于吸收周圍環(huán)境中DNA分子 在同時含有卡那霉素和氯霉素培養(yǎng)基上挑選能生長的大腸桿菌菌落 及時移除產物（更換培養(yǎng)液）

【解析】

基因工程技術的基本步驟：（1）目的基因的獲�。悍椒ㄓ袕幕�因文庫中獲取、利用PCR技術擴增和人工合成。（2）基因表達載體的構建：是基因工程的核心步驟，基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等。（3）將目的基因導入受體細胞：根據受體細胞不同，導入的方法也不一樣。將目的基因導入植物細胞的方法有農桿菌轉化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因導入動物細胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因導入微生物細胞的方法是感受態(tài)細胞法。（4）目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術；②檢測目的基因是否轉錄出了mRNA--分子雜交技術；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質--抗原-抗體雜交技術；個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

（1）多聚酶鏈式反應（PCR），是一種體外迅速擴增DNA片段的技術，它能以極少量的DNA為模板，在幾小時內復制出上百萬份的DNA拷貝。它可看作是生物體外的特殊DNA復制，PCR的最大特點，是能將微量的DNA大幅增加。PCR反應體系需要加入的有機物有DNA模板、dNTP、耐高溫DNA聚合酶和（兩種）引物。由于目的基因無法直接在受體細胞中表達，因此為了使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，能夠表達，實驗過程中不能將BCD基因、F基因以及T基因直接導入到大腸桿菌細胞內，而是構建重組質粒后再導入大腸桿菌。并能遺傳給下一代。圖中兩個重組質粒目的基因的首端都含有啟動子T7，T7是RNA聚合酶識別和結合的部位，能驅動基因轉錄。
（2）使體外重組的DNA分子轉移到受體細胞內，主要是借鑒細菌或病毒侵染細胞的途徑。一般將受體大腸桿菌用Ca2+處理，使細胞處于易于吸收周圍環(huán)境中DNA分子的感受態(tài)，使含有目的基因的重組質粒容易進入受體細胞。
（3）重組質粒1上含有BCD基因、T基因及卡那霉素抗性基因，重組質粒2上含有F基因、T基因及氯霉素抗性基因，因此在同時含有卡那霉素和氯霉素培養(yǎng)基上挑選單克隆大腸桿菌，就是同時含有BCD基因、F基因以及T基因的大腸桿菌。
（4）研究發(fā)現巴豆甜菜堿轉化成L-肉堿是一個可逆反應過程，在可逆反應中，減少生成物濃度，可使反應向正方向進行。因此得到的工程菌在含有巴豆甜菜堿培養(yǎng)基中培養(yǎng)2小時后，L-肉堿的含量基本穩(wěn)定，此時可以及時移除產物（更換培養(yǎng)液），使反應向生成L-肉堿的方向進行，以提高產量。