Question

9．圓褐固氮菌是自生固氮菌，為經(jīng)濟(jì)有效地提高農(nóng)作物產(chǎn)量，人們一直在努力研究、尋找固氮基因．對(duì)基因的研究常常因研究樣品中DNA含量太低而難以進(jìn)行，PCR技術(shù)有效地解決了這個(gè)問(wèn)題．如今對(duì)基因的深入研究使人類跨入了蛋白組研究時(shí)代，從復(fù)雜的細(xì)胞混合物中提取、分離高純度的蛋白質(zhì)是該研究要做的基本工作之一．
（1）某同學(xué)在做微生物實(shí)驗(yàn)時(shí)，不小心把圓褐固氮菌樣品和酵母菌樣品混在一起，已知青霉素會(huì)影響固氮菌的生長(zhǎng)繁殖，但不影響真菌的生長(zhǎng)繁殖．請(qǐng)?zhí)羁胀瓿煞蛛x這兩種菌的主要實(shí)驗(yàn)步驟：
①分別配置無(wú)氮（或不含氮和青霉素）的培養(yǎng)基和加青霉素（或加青霉素和氮）的培養(yǎng)基，分別分成兩份，依次標(biāo)上A、a、B、b備用；
②分別向A、B培養(yǎng)基接種混有兩種菌的樣品；
③把接種后的培養(yǎng)基放在恒溫箱中3d-4d；
④從A、B培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落中挑取生長(zhǎng)良好的菌株，分別接種到a、b培養(yǎng)基中；
⑤把接種后的培養(yǎng)基放在恒溫箱中3d-4d．
（2）用基因工程技術(shù)從經(jīng)過(guò)分離、提純的圓褐固氮菌中獲取固氮基因，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增．表1和表2分別表示用PCR擴(kuò)增固氮基因的反應(yīng)體系及反應(yīng)條件．
表1

PCR反應(yīng)體系	50ul
緩沖液	5ul
脫氧核苷酸	1ul
引物A	0.5ul
引物B	0.5ul
DNA聚合酶	0.5U
模板DNA	1-2ul
加去離子水補(bǔ)足至50ul

表2

反應(yīng)條件
	溫度	時(shí)間
變  性	95℃	30s
復(fù)  性	55℃	30s
延  伸	72℃	1min
30個(gè)循環(huán)后	適宜	5-10min
保  溫	4℃	2h

①?gòu)纳媳碇锌傻贸�，PCR技術(shù)與DNA復(fù)制相比較，主要區(qū)別之一是不需要ATP（或需要加入引物，或不需要解旋酶，或不需要DNA連接酶）；．此外，從反應(yīng)條件看，所使用的DNA聚合酶應(yīng)具有耐高溫的特點(diǎn)．每次循環(huán)都需要2種引物的主要原因是DNA聚合酶只能從3′端延伸DNA鏈．
②如圖1為第1輪循環(huán)產(chǎn)生的產(chǎn)物．請(qǐng)繪出以a鏈和b鏈為模板經(jīng)PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物．
（3）在對(duì)固氮基因產(chǎn)物的生產(chǎn)研究中，需要從復(fù)雜的細(xì)胞混合物中提取、分離高純度的蛋白質(zhì)．圖2表示蛋白質(zhì)提取和分離實(shí)驗(yàn)涉及的相關(guān)原理．
①圖甲表示相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)通過(guò)凝膠色譜法分離的過(guò)程．試管中收集到的液體最先出現(xiàn)的是相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)，原因是蛋白質(zhì)相對(duì)分子量較大，被排阻在凝膠顆粒外面，在顆粒之間迅速通過(guò)．
②圖乙所示實(shí)驗(yàn)?zāi)�擬電泳現(xiàn)象，U型管左側(cè)的顏色逐漸變深，原因是Fe（OH）₃膠體帶正電荷，在電場(chǎng)作用下，向陰極移動(dòng)．

Answer 1

分析 1、選擇培養(yǎng)基：選擇培養(yǎng)基是根據(jù)不同微生物在代謝過(guò)程中所需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和環(huán)境不同而配制的．不同微生物對(duì)某些化學(xué)藥品的抵抗力不同．利用這些特點(diǎn)，我們便可配制出適于某些微生物生長(zhǎng)而抑制其他微生物的選擇培養(yǎng)基，例如從土壤中分離放線菌時(shí)，可在培養(yǎng)基中加入10%的酚數(shù)滴，抑制細(xì)菌和真菌的生長(zhǎng)．
2、圓褐固氮菌是自生固氮菌，能在無(wú)氮培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)繁殖而酵母菌則不能；青霉素不影響酵母菌的生長(zhǎng)繁殖，而會(huì)抑制圓褐固氮菌的生長(zhǎng)繁殖．

解答 解：（1）①將微生物進(jìn)行分離一般采用選擇培養(yǎng)基．選擇培養(yǎng)基是在培養(yǎng)基中加入某種化學(xué)物質(zhì)，以抑制不需要的微生物的生長(zhǎng)，促進(jìn)所需要的微生物的生長(zhǎng)．圓褐固氮菌是自生固氮菌，能在無(wú)氮培養(yǎng)基上生長(zhǎng)繁殖，而酵母菌則不能；青霉素不影響酵母菌等真菌的生長(zhǎng)繁殖，而會(huì)抑制圓褐固氮菌的生長(zhǎng)繁殖．根據(jù)這一原理可將兩種微生物分離開來(lái)．所以分別配置 無(wú)氮（或不含氮和青霉素）的培養(yǎng)基和 加青霉素（或加青霉素和氮）的培養(yǎng)基，分別分成兩份，依次標(biāo)上A、a、B、b備用．
②分別向A、B培養(yǎng)基接種混有兩種茵的樣品；
④為了進(jìn)一步進(jìn)行提純，從A、B培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落中挑取生長(zhǎng)良好的菌株，分別接種到a、b培養(yǎng)基中；
⑤把接種后的培養(yǎng)基放在恒溫箱中3d-4d．
（2）①?gòu)纳媳碇锌傻贸觯琍CR技術(shù)與DNA復(fù)制相比較，不需要ATP（或需要加入引物，或不需要解旋酶，或不需要DNA連接酶）．PCR技術(shù)中DNA聚合酶應(yīng)具有耐高溫的特點(diǎn)．每次循環(huán)都需要2種引物的主要原因是DNA聚合酶只能從3′端延伸DNA鏈．
②根據(jù)圖1繪出以a鏈和b鏈為模板經(jīng)PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物的圖如下：

（3）在對(duì)固氮基因產(chǎn)物的生產(chǎn)研究中，需要從復(fù)雜的細(xì)胞混合物中提取、分離高純度的蛋白質(zhì)．圖2表示蛋白質(zhì)提取和分離實(shí)驗(yàn)涉及的相關(guān)原理．
①因?yàn)榈鞍踪|(zhì)相對(duì)分子量較大，被排阻在凝膠顆粒外面，在顆粒之間迅速通過(guò)，所以試管中收集到的液體最先出現(xiàn)的是相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)．
②Fe（OH）₃膠體帶正電荷，在電場(chǎng)作用下，向陰極移動(dòng)，導(dǎo)致U型管左側(cè)的顏色逐漸變深．
故答案為：
（1）①無(wú)氮（或不含氮和青霉素）     加青霉素（或加青霉素和氮）
②混有兩種菌的樣品     ④菌落；a、b培養(yǎng)基
⑤把接種后的培養(yǎng)基放在恒溫箱中3d-4d
（2）①不需要ATP（或需要加入引物，或不需要解旋酶，或不需要DNA連接酶）
耐高溫      DNA聚合酶只能從3′端延伸DNA鏈
②見圖

（3）①蛋白質(zhì)相對(duì)分子量較大，被排阻在凝膠顆粒外面，在顆粒之間迅速通過(guò)．
②Fe（OH）₃膠體帶正電荷，在電場(chǎng)作用下，向陰極移動(dòng)．

點(diǎn)評(píng) 本題難度適中，屬于考綱中識(shí)記、理解層次的要求，著重考查了微生物的分離與培養(yǎng)的相關(guān)知識(shí)，解答本題的關(guān)鍵是根據(jù)不同微生物的特點(diǎn)選擇恰當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基．