Question

【題目】水稻是世界上最重要的糧食作物之一，是全球約半數(shù)人口的主糧。然而水稻只有在磷營養(yǎng)充足的條件下才能保證高產(chǎn)。S基因是番茄線粒體中的磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，科研人員將S基因轉(zhuǎn)入水稻體內(nèi)，以期望獲得低磷條件下的高產(chǎn)水稻。操作流程如下：

（1）磷是構(gòu)成____等物質(zhì)的重要組成元素。土壤溶液中的磷濃度一般不超過2×10-12 mol/L，而植物細(xì)胞內(nèi)的磷濃度卻大于10×10-4 mol/L，因此植物從土壤中吸收磷的方式是____。

（2）提取番茄細(xì)胞的總RNA經(jīng)過____得到的cDNA，用限制酶處理后與載體結(jié)合并轉(zhuǎn)入受體菌體內(nèi)，建立番茄的_____，從中獲取S基因。但此途徑得到的S基因兩端沒有限制酶識別序列，利用____技術(shù)添加相應(yīng)序列并擴(kuò)增。已知Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄方向?yàn)轫槙r(shí)針，相關(guān)酶切位點(diǎn)如下表。

通過測序已知S基因部分序列如下：

請補(bǔ)充擴(kuò)增結(jié)束后，大多數(shù)DNA片段的堿基對序列____________ 。

（3）構(gòu)建含S基因的表達(dá)載體時(shí)，通常用兩種限制酶切割含S基因的DNA片段和Ti質(zhì)粒，限制酶作用部位為____（填化學(xué)鍵名稱）。將重組Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌時(shí)，可以用____處理農(nóng)桿菌，使得表達(dá)載體易于導(dǎo)入。為了使S基因能夠正確表達(dá)，還應(yīng)插入的元件是什么_________（請?jiān)谙聢D中畫出并標(biāo)注元件名稱）。

（4）將表達(dá)載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌以及農(nóng)桿菌與水稻愈傷組織共培養(yǎng)時(shí)需要進(jìn)行篩選，這兩步驟的培養(yǎng)基中都需要加入____，以篩選出成功導(dǎo)入表達(dá)載體的農(nóng)桿菌和水稻愈傷組織。

（5）GUS基因的產(chǎn)物能催化無色物質(zhì)K呈現(xiàn)藍(lán)色。經(jīng)無色物質(zhì)K處理愈傷組織并篩選出了呈現(xiàn)藍(lán)色的組織，說明____。

（6）農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒上的____序列，可以從農(nóng)桿菌中轉(zhuǎn)移并隨機(jī)插入到被侵染植物細(xì)胞的____中。隨機(jī)挑選三個(gè)轉(zhuǎn)基因株系甲、乙、丙進(jìn)行陽性檢測試驗(yàn)。分別提取每個(gè)樣品的基因組，利用限制酶進(jìn)行酶切電泳驗(yàn)證，結(jié)果如下圖所示，

甲、乙、丙轉(zhuǎn)基因植株中分別被轉(zhuǎn)入了____個(gè)S基因。

（7）通過盆栽轉(zhuǎn)基因株系，分別在低磷條件下和磷正常條件下測定____以驗(yàn)證轉(zhuǎn)入S基因是否能達(dá)到目的。測定結(jié)果如下圖。

結(jié)果顯示____，從而說明低磷條件下，S基因可以調(diào)控轉(zhuǎn)基因水稻對磷的吸收與積累，提高轉(zhuǎn)基因水稻產(chǎn)量。

（8）本實(shí)驗(yàn)的研究價(jià)值在于____。

Answer 1

【答案】ATP、磷脂、核酸 主動(dòng)運(yùn)輸 逆轉(zhuǎn)錄 cDNA文庫（部分基因文庫） PCR 磷酸二酯鍵 Ca2+ 氨芐青霉素 S基因在水稻細(xì)胞中已成功表達(dá) T-DNA 染色體DNA 3、2、3 單株產(chǎn)量 磷正常條件下單株產(chǎn)量與對照組相比，沒有顯著性差異；低磷條件下，三個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的單株產(chǎn)量均顯著高于對照組 充分挖掘植物自身高效吸收與利用磷素的磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，從根本上緩解低磷脅迫對包括水稻在內(nèi)的作物影響，從而實(shí)現(xiàn)低投入、高產(chǎn)出、少污染的農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要的意義

【解析】

基因工程的基本操作程序：

1、目的基因的獲取：
（1）目的基因是指： 編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因。
（2）獲取方法：①從基因文庫中獲取；②人工合成（反轉(zhuǎn)錄法和化學(xué)合成法）；③PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因。

2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建:
（1）目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳至下一代，使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。
（2）組成：目的基因+啟動(dòng)子+終止子+標(biāo)記基因。
①啟動(dòng)子：是一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得所需的蛋白質(zhì)。
②終止子：也是一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的尾端。
③標(biāo)記基因的作用：是為了鑒定受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細(xì)胞篩選出來。常用的標(biāo)記基因是抗生素基因。
（3）基因表達(dá)載體的構(gòu)建過程：


3、將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞:
（1）轉(zhuǎn)化的概念：是目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程。
（2）常用的轉(zhuǎn)化方法：常用方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、顯微注射技術(shù)、Ca2+處理法。
（3）重組細(xì)胞導(dǎo)入受體細(xì)胞后，篩選含有基因表達(dá)載體受體細(xì)胞的依據(jù)是標(biāo)記基因是否表達(dá)。

4、目的基因的檢測和表達(dá)：
（1）首先要檢測轉(zhuǎn)基因生物的染色體DNA上是否插入了目的基因，方法是采用DNA分子雜交技術(shù)。
（2）其次還要檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA，方法是用標(biāo)記的目的基因作探針與mRNA雜交。
（3）最后檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)，方法是從轉(zhuǎn)基因生物中提取蛋白質(zhì)，用相應(yīng)的抗體進(jìn)行抗原--抗體雜交。
（4）有時(shí)還需進(jìn)行個(gè)體生物學(xué)水平的鑒定。如轉(zhuǎn)基因抗蟲植物是否出現(xiàn)抗蟲性狀。

（1）細(xì)胞中含磷的物質(zhì)有核酸、ATP、磷脂；故磷是構(gòu)成核酸、ATP、磷脂等物質(zhì)的重要組成元素。細(xì)胞通過逆濃度梯度吸收磷，因此植物從土壤中吸收磷的方式是主動(dòng)運(yùn)輸。

（2）RNA經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA，用限制酶處理后與載體結(jié)合并轉(zhuǎn)入受體菌體內(nèi)，建立番茄的cDNA文庫（部分基因文庫），從cDNA文庫中獲取目的基因S。S基因兩端沒有限制酶識別序列，通過PCR技術(shù)添加相應(yīng)序列并擴(kuò)增。已知Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄方向?yàn)轫槙r(shí)針，通過圖示中重組質(zhì)粒分析，插入目的基因的左側(cè)所用的限制性酶是BamHI，右側(cè)所用的限制性酶是HindIII，再通過表格中限制性酶切割的具體堿基序列，結(jié)合S基因的堿基序列，可知擴(kuò)增結(jié)束后，大多數(shù)DNA片段的堿基對序列：

。

（3）限制酶催化斷裂的是磷酸二酯鍵。將重組Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌時(shí)，可以用Ca2+處理農(nóng)桿菌，使農(nóng)桿菌處于感受態(tài)。一個(gè)基因表達(dá)載體的組成，除了目的基因外，還必須有啟動(dòng)子和終止子，啟動(dòng)子位于基因的首端，終止子位于基因的尾端：。

（4）重組質(zhì)粒中有標(biāo)記基因--氨芐青霉素抗性基因，故為了篩選出成功導(dǎo)入表達(dá)載體的農(nóng)桿菌和水稻愈傷組織，培養(yǎng)基中都需要加入氨芐青霉素。

（5）圖示中可以看出，重組質(zhì)粒含GUS(β-葡糖苷酸酶)基因，GUS(β-葡糖苷酸酶)基因的產(chǎn)物能催化無色物質(zhì)K呈現(xiàn)藍(lán)色，根據(jù)這一特性。經(jīng)無色物質(zhì)K處理愈傷組織并篩選出了呈現(xiàn)藍(lán)色的組織，說明S基因在水稻細(xì)胞中已成功表達(dá)。

（6）農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒上的T-DNA序列，可以從農(nóng)桿菌中轉(zhuǎn)移并隨機(jī)插入到被侵染植物細(xì)胞的染色體DNA中。轉(zhuǎn)基因株系甲、乙、丙進(jìn)行陽性檢測試驗(yàn)結(jié)果，通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果看出，甲道出現(xiàn)3個(gè)條帶，乙道出現(xiàn)2個(gè)條帶，丙道出現(xiàn)3個(gè)條帶，故甲、乙、丙轉(zhuǎn)基因植株中分別被轉(zhuǎn)入了3、2、3個(gè)S基因。

（7）通過柱形圖的縱軸可知，通過盆栽轉(zhuǎn)基因株系，分別在低磷條件下和磷正常條件下測定單株產(chǎn)量相對值以驗(yàn)證轉(zhuǎn)入S基因是否能達(dá)到目的。測定結(jié)果顯示磷正常條件下單株產(chǎn)量與對照組相比，沒有顯著性差異；低磷條件下，三個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的單株產(chǎn)量均顯著高于對照組，從而說明低磷條件下，S基因可以調(diào)控轉(zhuǎn)基因水稻對磷的吸收與積累，提高轉(zhuǎn)基因水稻產(chǎn)量。

（8）本實(shí)驗(yàn)的研究價(jià)值在于充分挖掘植物自身高效吸收與利用磷素的磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，從根本上緩解低磷脅迫對包括水稻在內(nèi)的作物影響，從而實(shí)現(xiàn)低投入、高產(chǎn)出、少污染的農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要的意義。