Question

【題目】下圖是某基因工程中構(gòu)建重組質(zhì)粒的過程示意圖，載體質(zhì)粒P0具有四環(huán)素抗性基因（tet r）和氨芐青霉素抗性基因（ampr）。請回答：

（1）EcoR V酶切P0形成的末端為______末端。

（2）通過PCR擴增獲得的目的基因，其兩端各自帶有一個鳥嘌呤脫氧核苷酸。為了能使載體P1能與目的基因連接，可以用______酶處理，在兩端各添加了一個堿基為______的脫氧核苷酸，形成P2。

（3）為篩選出含有重組質(zhì)粒P3的菌落，采用含有不同抗生素的培養(yǎng)基進行篩選，得到A、B、C三類菌落，其生長情況如下表（“+”代表生長，“﹣”代表不生長）。結(jié)果表明，菌落______是符合要求的。

	A	B	C
無抗生素	+	+	+
氨芐青霉素	+	+	-
四環(huán)素	+	-	-
氨芐青霉素+四環(huán)素	+	-	-

（4）為鑒定篩選出的菌落中是否含有正確插入目的基因的重組質(zhì)粒，擬設(shè)計引物進行PCR鑒定。如圖所示為甲、乙、丙3條引物在正確的重組質(zhì)粒中的相應位置。

①引物中A＋T比例越高，PCR過程中退火溫度越______。PCR中提供的酶是______。

②某學生用一對引物甲和乙從某一菌落的質(zhì)粒中擴增出了400bp的片段，原因是______。PCR過程中需要提供引物的原因是______。

Answer 1

【答案】平 DNA聚合酶 胞嘧啶（C） B 低 Taq酶 目的基因反向連接 Taq酶不能從頭開始合成DNA，只能從3’端延伸DNA鏈

【解析】

基因表達載體的基本結(jié)構(gòu)包括復制原點、目的基因、標記基因、啟動子、終止子等。根據(jù)題干信息和圖形分析，P0是載體質(zhì)粒，其含有的氨芐青霉素抗性基因（ampr）和四環(huán)素抗性基因（tetr）都屬于標記基因，可以用檢測目的基因是否導入受體細胞；EcoRV酶為限制酶，其切割質(zhì)粒后會破壞了四環(huán)素抗性基因（tetr）。

（1）根據(jù)圖示分析，EcoRV酶切P0形成的線性載體P1為平末端。

（2）據(jù)圖分析，目的基因兩側(cè)為粘性末端，且露出的堿基為G，為了能使載體P1能與目的基因連接，可以用DNA聚合酶處理，在載體P1的兩端需要再加一個堿基C（胞嘧啶），形成具有粘性末端的載體P2。

（3）根據(jù)以上分析已知，限制酶切割后破壞了四環(huán)素抗性基因，但是沒有破壞氨芐青霉素抗性基因，因此含有重組質(zhì)粒P3的菌落在四環(huán)素中應該不能生長，而在氨芐青霉素的培養(yǎng)基中能生長，結(jié)合表格分析可知，應該選擇B類菌落。

（4）①DNA分子中堿基對A與T之間有2個氫鍵，C與G之間有3個氫鍵，所以引物中A＋T比例越高，PCR過程中退火溫度越低。PCR中提供的酶為熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶）。

②根據(jù)題意和圖形分析，某同學用圖中的一對引物（甲、乙）從某一菌落的質(zhì)粒中擴增出了400bp的片段，說明其目的基因發(fā)生了反向連接，否則擴增出的應該是100 bp的片段。由于Taq酶不能從頭開始合成DNA，只能從3’端延伸DNA鏈，所以PCR過程中需要提供引物。