Question

【題目】黑胸大蠊是一種生活在我國(guó)南方地區(qū)的主要衛(wèi)生害蟲，通過(guò)生物防治手段可以起到一定抑制蟲害的作用。某研究小組對(duì)黑胸大蠊?jié)夂瞬《镜腜fDNV基因與pUCl19質(zhì)粒進(jìn)行重組構(gòu)建，通過(guò)感染黑胸大蠊研究其病理特征，已知KpnⅠ、PstⅠ、HindⅢ3種限制酶的酶切位點(diǎn)不同，Amp為氨芐青霉素抗性基因，實(shí)驗(yàn)過(guò)程圖解如下。請(qǐng)分析回答下列問(wèn)題：

（1）純化后的PfDNV基因可通過(guò)___________技術(shù)擴(kuò)增。常將PfDNV基因與pUC119 質(zhì)粒采取加G—C尾的連接方式構(gòu)建重組質(zhì)粒，該加尾的連接方式能使重組質(zhì)粒的熱穩(wěn)定性___________。

（2）研究小組將獲得的重組質(zhì)粒通過(guò)___________法轉(zhuǎn)染大腸桿菌，在含有___________的培養(yǎng)基上培養(yǎng)一段時(shí)間后，挑選出部分菌株，用HindⅢ酶解菌株中的重組質(zhì)粒，經(jīng)電泳分析后發(fā)現(xiàn)有些菌株顯示有5kb和3.7kb片段，還有些菌株顯示有1.8kb和6.9kb片段，出現(xiàn)這種情況的原因是______________________。

（3）選擇可以正常表達(dá)的重組質(zhì)粒PfDNV-pUCl19，利用KpnⅠ酶酶解后回收7.3kb的片段，通過(guò)_______的作用獲得PfΔKpn-pUC119重組質(zhì)粒，將兩種重組質(zhì)粒通過(guò)腹部注射法注入黑胸大蠊幼蟲體內(nèi)，所得的結(jié)果如下表所示。

質(zhì)粒轉(zhuǎn)染黑胸大蠊實(shí)驗(yàn)結(jié)果

接種物	接種蟲數(shù)	感染蟲數(shù)	感染百分?jǐn)?shù)（%）
PfΔKpn-pUC119
（2500ng）	20	20	100
（1250ng）	20	1S	90
（250ng）	20	17	85
PfAKpn-pUC119
（2300ng）	20	0	0
（1000ng）	20	0	0
野生型病毒	20	20	100
未接種	20	0	0

從上表中可以看出，當(dāng)注射的重組質(zhì)粒PfDNV-pUCl19的量在___________ng及以上時(shí)，蟲體最終死亡率與野生型病毒感染的結(jié)果—致。PfΔKpn-pUC119重組質(zhì)粒注射幼蟲后沒(méi)有感染的根本原因是：KpnⅠ酶酶解后再連接，導(dǎo)致______________________。

Answer 1

【答案】 PCR 提高 感受態(tài)轉(zhuǎn)化（冰凍的氣化鈣溶液處理） 氨芐青霉素 基因和質(zhì)粒的正向和反向連接 DNA連接酶 2500 PfDNV基因缺失了部分片段

【解析】試題分析：本題綜合考查學(xué)生對(duì)基因工程的知識(shí)的識(shí)記和理解能力。解答本題需熟記并理解基因工程的基本操作程序并形成清晰的知識(shí)網(wǎng)絡(luò)。在此基礎(chǔ)上，結(jié)合問(wèn)題情境，從題圖和題意中提取有效信息，進(jìn)行相關(guān)問(wèn)題的解答。

(1)純化后的PfDNV基因可通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增。常將PfDNV基因與pUC119 質(zhì)粒采取加G—C尾的連接方式構(gòu)建重組質(zhì)粒，可使該“重組質(zhì)粒”中的G—C堿基比例增加。DNA分子含有的氫鍵數(shù)越多，其結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定，在每個(gè)DNA分子中，堿基對(duì)A與T之間有2個(gè)氫鍵，C與G之間有3個(gè)氫鍵，所以該加尾的連接方式能使重組質(zhì)粒的熱穩(wěn)定性提高。

(2)研究小組將獲得的重組質(zhì)粒通過(guò)感受態(tài)轉(zhuǎn)化（冰凍的氯化鈣溶液處理）法轉(zhuǎn)染大腸桿菌。重組質(zhì)粒含有的Amp為氨芐青霉素抗性基因，使其對(duì)氨芐青霉素有抗性。在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)一段時(shí)間后，可將成功導(dǎo)入目的基因的菌株挑選出來(lái)。HindⅢ酶解菌株中的重組質(zhì)粒，經(jīng)電泳分析后發(fā)現(xiàn)有些菌株顯示有5kb和3.7kb片段，還有些菌株顯示有1.8kb和6.9kb片段，結(jié)合圖示分析可推知：出現(xiàn)這種情況的原因是基因和質(zhì)粒的正向和反向連接。

(3)通過(guò)DNA連接酶可將KpnⅠ酶解后回收的7.3kb的片段連接，進(jìn)而獲得PfΔKpn-pUC119重組質(zhì)粒。分析表中信息可知：當(dāng)注射的重組質(zhì)粒PfDNV-pUCl19的量在2500 ng及以上時(shí)，蟲體最終死亡率與野生型病毒感染的結(jié)果—致。PfΔKpn-pUC119重組質(zhì)粒注射幼蟲后沒(méi)有感染的根本原因是：KpnⅠ酶解后再連接，導(dǎo)致PfDNV基因缺失了部分片段。