Question

18．在某些深海魚中發(fā)現(xiàn)的抗凍蛋白基因afp對提高農(nóng)作物的抗寒能力有較好的應(yīng)用價值．如圖所示是獲得轉(zhuǎn)基因萵苣的技術(shù)流程，請據(jù)圖回答下列問題：
（1）獲取目的基因的主要途徑包括從獲取直接分離獲得和人工合成方法．
（2）基因工程的核心步驟是基因表達載體的構(gòu)建．①過程需要的酶有限制酶、DNA連接酶．
（3）重組質(zhì)粒除了帶有抗凍蛋白基因afp以外，還必須含有啟動子、終止子和標記基因，這樣才能構(gòu)成一個完整的基因表達載體．
（4）目的基因進入受體細胞C₂，并將其插入到受體細胞C₂中染色體的DNA上，使目的基因的遺傳特性得以穩(wěn)定維持和表達，形成轉(zhuǎn)基因萵苣，該過程叫轉(zhuǎn)化作用．經(jīng)②過程獲得的轉(zhuǎn)基因萵苣中的目的基因是否表達，在分子水平上可用抗原-抗體雜交法進行檢測，如果出現(xiàn)雜交帶，說明目的基因已經(jīng)表達蛋白質(zhì)產(chǎn)品，轉(zhuǎn)基因萵苣培育成功．
（5）科學(xué)家在培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因植物時，常用農(nóng)桿菌中的質(zhì)粒做運載體．借助于該質(zhì)粒上的片段將目的基因整合到受體細胞的染色體DNA上．該方法叫農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法．
（6）質(zhì)粒是基因工程最常用的運載體，它具備運載體的條件：
①能夠在宿主細胞中復(fù)制并穩(wěn)定地保存；②具有多個酶切位點，以便與外源基因連接；③具有某些標記基因，便于進行篩選．

Answer 1

分析 基因工程的操作步驟為
第一步：目的基因的獲取
（1）目的基因是指：編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因．
（2）原核基因采取直接分離獲得，真核基因是人工合成．人工合成目的基因的常用方法有反轉(zhuǎn)錄法和化學(xué)合成法．
（3）PCR技術(shù)擴增目的基因
第二步：基因表達載體的構(gòu)建
（1）目的：使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳至下一代，使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用．
（2）組成：目的基因+啟動子+終止子+標記基因
第三步：將目的基因?qū)�入受體細胞
（1）轉(zhuǎn)化的概念：是目的基因進入受體細胞內(nèi)，并且在受體細胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達的過程．
（2）常用的轉(zhuǎn)化方法：
將目的基因?qū)�入植物細胞：采用最多的方法是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，其次還有基因槍法和花粉管通道法等．
將目的基因?qū)�入動物細胞：最常用的方法是顯微注射技術(shù)．此方法的受體細胞多是受精卵．
將目的基因?qū)�入微生物細胞：Ca²⁺轉(zhuǎn)化法．
（3）重組細胞導(dǎo)入受體細胞后，篩選含有基因表達載體受體細胞的依據(jù)是標記基因是否表達．
第四步：目的基因的檢測和表達
（1）首先要檢測轉(zhuǎn)基因生物的染色體DNA上是否插入了目的基因，方法是采用DNA分子雜交技術(shù)．
（2）其次還要檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA，方法是用標記的目的基因作探針與mRNA雜交．
（3）最后檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)，方法是從轉(zhuǎn)基因生物中提取蛋白質(zhì)，用相應(yīng)的抗體進行抗原--抗體雜交．
（4）有時還需進行個體生物學(xué)水平的鑒定．如轉(zhuǎn)基因抗蟲植物是否出現(xiàn)抗蟲性狀．

解答 解：（1）目的基因的獲取可采取直接分離獲得也可采用人工合成方法，人工合成目的基因的常用方法有反轉(zhuǎn)錄法和化學(xué)合成法．              
（2）基因工程的核心步驟是基因表達載體的構(gòu)建；提取目的基因需限制酶，將目的基因與運載體結(jié)合需DNA連接酶，故①過程需要的酶有限制酶和DNA連接酶．           
（3）基因表達載體包含：目的基因+啟動子+終止子+標記基因．          
（4）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法利用的是農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化作用，將目的基因整合到受體細胞的染色體DNA上，進而使目的基因能夠穩(wěn)定遺傳和表達．檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA，方法是用標記的目的基因作探針與mRNA雜交．最后檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)，方法是從轉(zhuǎn)基因生物中提取蛋白質(zhì)，用相應(yīng)的抗體進行抗原--抗體雜交．
（5）將目的基因?qū)�入植物細胞常用的方法是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，檢測轉(zhuǎn)基因生物的染色體DNA上是否插入了目的基因，方法是采用DNA分子雜交技術(shù)．
（6）科學(xué)家在培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因植物時，常用原核生物中的質(zhì)粒做運載體．質(zhì)粒是基因工程最常用的運載體，它具備運載體條件：①能夠在宿主細胞中自我復(fù)制；②至少一個酶切位點，便于外源基因連接；③具有某些標記基因，便于目的基因的鑒定與篩選．
故選答案為：
（1）直接分離獲得  人工合成方法
（2）基因表達載體的構(gòu)建   限制酶 DNA連接酶
（3）標記基因
（4）染色體的DNA  轉(zhuǎn)化作用  抗原-抗體雜交
（5）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法
（6）復(fù)制  酶切位點   標記基因

點評 本題考查了基因工程的有關(guān)知識，要求考生能夠掌握基因工程的操作工具、操作步驟以及相應(yīng)的生理基礎(chǔ)等；識記質(zhì)粒能夠作為運載體的條件等，難度適中，屬于考綱中識記、理解層次的考查．